Zakladatel Bohuslav založil na Starém Městě pražském špitál pro chudé nemocné a kapli sv. Šimona a Judy. Vznikly tak základy jedné z nejstarších nemocnic v Evropě a vůbec nejstarší nemocnice na českém území s nepřetržitou kontinuitou v poskytování zdravotní péče.

Po bitvě na Bílé hoře daroval císař Ferdinand II. objekty špitálu a kaple, včetně rozsáhlé zahrady, jako konfiskát řádu milosrdných bratří.

Zahájení stavebních úprav původního špitálu a okolních zahrad znamenalo klíčový milník, kdy se nemocnice začala postupně rozrůstat a formovat do podoby, jakou známe dnes.

Pověst praví, že při rekonstrukci nemocnice bylo využito dřevo z popraviště, na němž našlo smrt 27 českých pánů. Toto dřevo, považované za znesvěcené, prý po dlouhé měsíce leželo na Staroměstském náměstí, aniž by se ho kdokoliv chtěl ujmout. Nakonec se z něj měly stát nosné prvky nové podoby nemocnice – krovy či trámy, zatímco zbylé dřevo posloužilo k vytvoření jednoho z nemocničních schodišť. Identita tohoto schodiště a pravdivost této pověsti však dodnes zůstávají zahaleny tajemstvím.

Roku 1624 byla v nemocnici otevřena lékárna pro veřejnost

Roku 1632 byl vysvěcen nový kostel navazující na nemocniční areál

Pitva, která se uskutečnila roku 1685 v nemocnici milosrdných bratří, svědčila o pokroku v medicínském vzdělávání tehdejší doby. Chirurg prováděl pitvu, zatímco profesor medicíny dohlížel na průběh pitvy a doprovázel ji svým výkladem určeným přihlížejícím medikům.

V letech 1751–1753 bylo prodlouženo průčelní křídlo nemocnice do podoby, kterou známe dnes. Z ulice U Milosrdných můžeme obdivovat nejen jeho architekturu, ale také galerii soch na střeše této dvoupatrové budovy.

Významnou postavou z dějin českého lékařství je Jan Theobald Held, který v nemocnici milosrdných bratří působil od své promoce v červenci 1797 po tři desetiletí, do roku 1827. Během svého působení se zasadil o řadu významných přínosů, zejména během tyfové epidemie v letech 1799–1803, kdy se zasloužil o snížení úmrtnosti (ve srovnání s jinými zdravotnickými zařízeními). Během napoleonských válek, kdy se nemocnice potýkala s finančními problémy, pomohl Held nemocnici získat finanční dar od hraběte Kolovrata, což jí umožnilo další fungování.

6. února 1847 byl v nemocnici milosrdných bratří poprvé v Čechách proveden chirurgický zákrok za použití celkové narkózy. Aplikaci éterové anestezie provedl chirurg a člen řádu milosrdných bratří Celestýn Opitz. Tento objev přinesl nejen obrovskou úlevu nemocným, kteří byli zbaveni ukrutných bolestí během chirurgických zákroků, ale také obrovský věhlas nemocnici.

Na počátku 20. století prošla nemocnice významnou modernizací. Na místě zbořeného severního křídla se podařilo na nábřeží vybudovat zdařilou funkční přístavbu, která byla velmi dobře vybavená moderními přístroji (rentgen, horské slunce, diatermie, vanové, parní a elektrické lázně, chemická a bakteriologická laboratoř). Měla také specializovaná oddělení pro choroby vnitřní, chirurgické, ušní a nosní, oční a infekční.

Nová hlavní budova nemocnice byla otevřena roku 1927. Na její výstavbu přispěli mezi jinými také papež Pius XI., prezident T. G. Masaryk a další. Přístavbu navrhli dva známí meziváleční architekti V. Kvasnička a J. Mayer. Budova má podobu ležatého E, jehož střední část je spojnicí se starou zástavbou. Unikátně architekti vyřešili pojetí operačních sálů, nacházejících se v nejvyšším patře budovy, jejichž panoramatická okna nabízejí krásné výhledy na Vltavu, Letnou a Pražský hrad. Kapacita nemocnice vzrostla na 200–280 lůžek.

Za 2. světové války zabrali nemocnici okupanti pro německou armádu. Nemocnici převzala luftwaffe a zřídila zde vojenskou nemocnici. Po osvobození v roce 1945 se nemocnice stala opět řádovou, ovšem pouze do komunistického převratu v únoru 1948, kdy byla zestátněna.

V roce 1965 bylo v Nemocnici Na Františku otevřeno první lůžkové anesteziologicko-resuscitační oddělení (ARO) v Československu. Tato událost představuje významný milník v historii českého zdravotnictví. Oddělení bylo moderně koncipované a kompletně technicky vybavené. Pro pacienty bylo k dispozici 14 monitorovaných lůžek s ventilátory, což představovalo ve své době průlomový posun v oblasti péče o pacienty v kritickém stavu.