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Der Gründer Bohuslav errichtete in der Prager Altstadt ein Krankenhaus für arme Kranke sowie die Kapelle der Heiligen Simon und Judas. Damit wurden die Grundlagen für eines der ältesten Krankenhäuser Europas und das älteste Krankenhaus auf tschechischem Gebiet mit ununterbrochener Kontinuität in der medizinischen Versorgung gelegt.

Nach der Schlacht am Weißen Berg schenkte Kaiser Ferdinand II. die Gebäude des Spitals und der Kapelle, einschließlich des weitläufigen Gartens, als Konfisziertes dem Orden der Barmherzigen Brüder.

Der Beginn der Umbauarbeiten am ursprünglichen Spital und den umliegenden Gärten stellte einen entscheidenden Meilenstein dar, ab dem sich das Krankenhaus nach und nach ausdehnte und zu der Gestalt entwickelte, die wir heute kennen.

Der Legende nach wurde bei der Renovierung des Krankenhauses Holz vom Schafott verwendet, auf dem 27 tschechische Adlige den Tod fanden. Dieses Holz, das als entweiht galt, soll monatelang auf dem Altstädter Ring gelegen haben, ohne dass es jemand haben wollte. Schließlich sollte es zu tragenden Elementen des neuen Krankenhausgebäudes werden – zu Dachstühlen oder Balken, während das restliche Holz zur Errichtung einer der Krankenhaustreppen diente. Die Identität dieser Treppe und die Wahrhaftigkeit dieser Legende bleiben jedoch bis heute ein Geheimnis.

Im Jahr 1624 wurde im Krankenhaus eine Apotheke für die Öffentlichkeit eröffnet

Im Jahr 1632 wurde die neue Kirche geweiht, die an den Krankenhauskomplex angrenzt

Die Autopsie, die 1685 im Krankenhaus der Barmherzigen Brüder stattfand, zeugte vom Fortschritt in der medizinischen Ausbildung jener Zeit. Der Chirurg führte die Autopsie durch, während der Medizinprofessor den Ablauf überwachte und sie mit Erläuterungen für die anwesenden Medizinstudenten begleitete.

In den Jahren 1751–1753 wurde der Frontflügel des Krankenhauses zu seiner heutigen Form erweitert. Von der Straße „U Milosrdných“ aus kann man nicht nur seine Architektur bewundern, sondern auch die Skulpturengalerie auf dem Dach dieses zweistöckigen Gebäudes.

Eine bedeutende Persönlichkeit in der Geschichte der tschechischen Medizin ist Jan Theobald Held, der seit seiner Promotion im Juli 1797 drei Jahrzehnte lang, bis zum Jahr 1827, im Krankenhaus der Barmherzigen Brüder tätig war. Während seiner Tätigkeit leistete er eine Reihe bedeutender Beiträge, insbesondere während der Typhusepidemie in den Jahren 1799–1803, als er sich um die Senkung der Sterblichkeitsrate (im Vergleich zu anderen medizinischen Einrichtungen) verdiente. Während der Napoleonischen Kriege, als das Krankenhaus mit finanziellen Problemen zu kämpfen hatte, verhalf Held dem Krankenhaus zu einer finanziellen Spende von Graf Kolovrat, wodurch dessen Weiterbetrieb gesichert wurde.

Am 6. Februar 1847 wurde im Krankenhaus der Barmherzigen Brüder zum ersten Mal in Böhmen ein chirurgischer Eingriff unter Vollnarkose durchgeführt. Die Ätheranästhesie wurde vom Chirurgen und Mitglied des Ordens der Barmherzigen Brüder, Celestýn Opitz, durchgeführt. Diese Errungenschaft brachte nicht nur eine enorme Erleichterung für die Patienten, die während der chirurgischen Eingriffe von qualvollen Schmerzen befreit wurden, sondern verschaffte dem Krankenhaus auch großen Ruhm.

Zu Beginn des 20. Jahrhunderts wurde das Krankenhaus umfassend modernisiert. An der Stelle des abgerissenen Nordflügels gelang es, am Ufer einen gelungenen, zweckmäßigen Anbau zu errichten, der sehr gut mit modernen Geräten ausgestattet war (Röntgen, Sonnenlampe, Diathermie, Wannen-, Dampf- und Elektrobäder, chemisches und bakteriologisches Labor). Es verfügte zudem über Fachabteilungen für Innere Medizin, Chirurgie, Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde, Augenheilkunde und Infektionskrankheiten.

Das neue Hauptgebäude des Krankenhauses wurde 1927 eröffnet. Zu seinem Bau trugen unter anderem Papst Pius XI., Präsident T. G. Masaryk und andere bei. Der Anbau wurde von den beiden bekannten Architekten der Zwischenkriegszeit, V. Kvasnička und J. Mayer, entworfen. Das Gebäude hat die Form eines liegenden E, dessen mittlerer Teil eine Verbindung zur alten Bebauung bildet. Auf einzigartige Weise lösten die Architekten die Gestaltung der Operationssäle, die sich im obersten Stockwerk des Gebäudes befinden und deren Panoramafenster einen wunderschönen Blick auf die Moldau, Letná und die Prager Burg bieten. Die Kapazität des Krankenhauses stieg auf 200–280 Betten.

Während des Zweiten Weltkriegs wurde das Krankenhaus von den Besatzern für die deutsche Armee beschlagnahmt. Die Luftwaffe übernahm das Krankenhaus und richtete dort ein Lazarett ein. Nach der Befreiung im Jahr 1945 wurde das Krankenhaus wieder zu einem Ordenskrankenhaus, allerdings nur bis zum kommunistischen Staatsstreich im Februar 1948, als es verstaatlicht wurde.

Im Jahr 1965 wurde im Krankenhaus Na Františku die erste stationäre Anästhesie- und Reanimationsstation (ARO) in der Tschechoslowakei eröffnet. Dieses Ereignis stellt einen bedeutenden Meilenstein in der Geschichte des tschechischen Gesundheitswesens dar. Die Station war modern konzipiert und technisch vollständig ausgestattet. Den Patienten standen 14 überwachte Betten mit Beatmungsgeräten zur Verfügung, was zu jener Zeit einen bahnbrechenden Fortschritt in der Versorgung von Patienten in kritischem Zustand darstellte.